روش‌های سریع تشخیص و شمارش میکروبی در آزمایشگاه‌های صنعت دارو

به طور کل آزمایش‌های میکروبی در آزمایشگاه صنعت دارو بیشتر از تمام بخش‌ها و صنایع دیگر مجبور به رعایت الزامات قانونی می‌باشند، این الزامات نه تنها شامل مکان‌، زمان‌ و توالی نمونه برداری و انجام این آزمایشات می‌باشد، بلکه روش انجام این آزمون‌‌ها را نیز در بر می‌گیرد.
با اینکه مقررات سختیگرانه و ارائه الزامات واضح برای آزمایشات مفید است، از جهاتی می‌تواند به عنوان مانعی برای استقرار روش‌های آزمایش نوین باشد. با این حال تمرکز قابل توجهی که اخیراً بر روی ریلیز پارامتری محصول (Parametric Release) و رویکرد مبتنی بر ریسک بر اساس احراز کیفیت توسط طراحی(Quality By Design)  جهت تولید و توسعه فرآیند‌ها شده، باعث شده این موانع‌ ضعیف‌تر و در برخی موارد شکسته شوند.
مثال خوبی از تاکید بر تغییر در قوانین نظارتی، Process Analytical Technology  یا تکنولوژی تحلیلی فرآیند(PAT)  است. PAT به عنوان یک سیستم برای طراحی و کنترل تولید از طریق اندازه گیری‌های به هنگام (در حین فرآیند) کیفیت و عملکرد اصلی مواد خام و حد واسط، همچنین فرایندهایی با هدف تضمین کیفیت محصول نهایی تعریف شده است. در واقع هدف این است که با به کارگیری فناوری تحلیلی مدرن به کمک ابزار مدیریت اطلاعات و آنالیز و شناسایی و کنترل پارامترهای حیاتی که بر فرآیند تأثیر می گذارد،کیفیت فرآیند را افزایش دهد. PAT در ایالات متحده آمریکا توسط FDA PAT ابداع و در اتحادیه اروپا توسط اداره داروی اروپا EMEA توصیه شده است. اهداف کلیدی PAT:

• حصول نتیجه در کمترین زمان
• بهبود حساسیت و اختصاصیت
• ریلیز محصول دارویی در زمان کوتاهتر
• ارتقاء کنترل فرآیند

این تغییرات نهایتاً موجب پیشرفت مطلوب و جایگزینی روش‌های میکروبشناسی سریع و جدید (RMM) به جای روش‌های قدیمی در آزمایشگاه‌های میکروبی صنعت دارویی شده‌است. به طور کلی روش‌های میکروبشناسی سنتی در PAT ارزش ناچیزی دارند، چرا که حصول نتیجه بسیار زمانبر می‌باشد. در صورتیکه با ابداعات جدید RMM کسب نتایج در زمان واقعی ممکن شده است چرا که دستیابی به نتایج میکروب شناسی در مدت زمان کوتاه نه تنها به ریلیز سریع و به موقع محصول منجر می‌شود، بلکه جهت مانیتورینگ و کنترل مستمر مراحل فرآیند نیز مفید خواهد بود. به این جهت اکثر میکروبیولوژیست‌ها و مدیران صنعت دارو به دنبال روش‌های سریع و مطمئن شناسایی و تشخیص میکروبی می‌باشند. در ادامه به جدیدترین و کارآمدترین روش‌های تشخیص و کنترل میکروبی موجود در بازار در مورد صنعت داروسازی اشاره می‌کنیم:
هدف کلی از بکارگیری روش‌های RMM در صنعت داروسازی حصول اطمینان از خصوصیات میکروبیولوژیکی محصول نهایی برای ریلیز سریعتر محصول به بازار می‌باشد که نهایتاً زمان کوتاهتر در رسیدن به نتایج باعث صرفه جویی قابل توجه در هزینه‌ها می‌شود. علاوه بر این RMM می‌تواند نقش کلیدی در نتایج آزمایش مربوط به بخش‌های زیر داشته باشد:

• آزمایشات مواد اولیه دارویی
• آزمایشات حین فرآیند
• آزمایشات تعیین محدوده میکروبی
• آزمایشات تعیین بار میکروبی (Bioburden)
• آزمایشات فرآیند تولید آب خالص، فوق خالص، آب قابل تزریق و بخار استریل در صنعت دارو
• پایش محیطی
• آزمایشات استریلیتی

تمامی موارد فوق به خصوص آزمایشات مربوط به شناسایی میکروبی در زمینه ماده خام دارویی، تعیین بار میکروبی و پایش محیطی، می‌توانند به استقرار PAT و ریلیز پارامتریک محصول کمک کنند. استقرار RMM با فراهم آوردن امکان تجزیه و تحلیل به موقع داده‌ها به اعلام هشدار و بر طرف کردن زودهنگام مشکلات آلودگی میکروبی و در آینده نزدیک به پایش بدون وقفه در فرآیند تولید کمک کرده و باعث صرفه جویی قابل توجهی در زمان و هزینه تولید می‌شود.

روش‌های جدید و سریع کنترل میکروبی:

بسیاری از روشهای مانیتورینگ میکروبی طی20 تا 30 سال اخیر توسعه یافته‌اند. اکثر این موارد در بخش بالینی و به میزان کمتر در بخش تولید مواد غذایی و میکروبیولوژی آب عرضه شده است. با این وجود برخی از آن‌ها در صنعت  دارویی نیز کاربردهای خاصی دارند و تعدادی نیز تنها برای صنعت داروسازی ساخته شده اند.

1. 1. • فناوری بر پایه رشد در محیط کشت:

این روش‌ها با روش‌های سنتی کشت تفاوت‌‍‌هایی دارند، زیرا این روش‌های جدید برپایه تشخیص شاخص های رشد فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی به جای رشد چشمی و مشاهده کلونی میکروبی می‌باشند. به همین علت این روش‌ها دارای سرعت قابل ملاحظه‌ای در مقایسه با روش‌های سنتی هستند، با  این حال این‌ها نیز نیاز به یک مرحله غنی سازی به خصوص در مواردی که مقدار آلودگی نمونه پائین است، دارند. نمونه هایی از RMM مبتنی بر رشد عبارت‌اند از:

1. 1. • ATP بیولومینسانس (آدنوزین تری فسفات بیولومینسانس)

یک روش سریع برای تعیین سطح آلودگی در مواد خام و محصولات دارویی است. دراین روش نور ساطع شده از ترکیب سوبسترای لوسیفرین (که به ملکول ATP میکروبی متصل شده است) و آنزیم لوسیفراز با استفاده از یک لومینومتر اندازه‌گیری می‌شود. میزان نور تولید شده ارتباط مستقیم با تعداد میکروارگانیسم داخل نمونه مورد آزمایش دارد. اشکال این روش در عدم تفکیک بین میکروب و سلول‌های گیاهی و جانوری داخل نمونه است که با استفاده از فیلتراسیون با فیلتر های 5 میکرومتری  و همچنین بکارگیری آنزیم لوسیفراز همراه با سورفاکتانت این مشکل قابل حل می‌شود. در این روش اگر مقدار آلودگی میکروبی کمتر از  100 CFU باشد، پیشنهاد می‌شود قبل از انجام آزمایش یک مرحله غنی سازی انجام . سنجش بار میکروبی در این روش بدون در نظر گرفتن مرحله غنی سازی  فقط حدود چند دقیقه طول می‌کشد.

1. 1. • شناسایی و شمارش میکروبی به کمک تغییرات فشار ناشی از تنفس سلولی (رسپیرومتری)

در این روش که بر پایه فراهم آوری بهترین شرایط هوارسانی و مواد مغذی و تأمین شرایط دمایی بهینه جهت به حداقل رساندن فاز آداپتیشن میکروبی در محیط کشت کاملاً اختصاصی و افتراقی می‌باشد، میکروارگانیسم مورد نظر پس از طی دوره کمون کوتاه مدت شروع به تنفس هوازی یا بیهوازی می‌کند و تغییرات فشار متأثر از این تنفس ثبت و ضبط می‌گردد.

1. 1. • شناسایی میزان رشد میکروبی به روش رنگ سنجی

مبنای این روش تغییر رنگ مواد رنگزای داخل محیط کشت است که حاصل از رشد و متابولیسم میکروارگانیسم داخل نمونه می‌باشد. CO2 از تولیدات متابولیکی اصلی میکروارگانیسم‌ها بوده که با اسیدی کردن محیط باعث تغییر رنگ بسیاری از معرف‌ها مثل بروموکروزوپرپل می‌شود. واضح است که در این روش تنها میکروارگانیسم‌هایی که هوازی و قادر به تولید متابولیت‌های اسیدی می‌باشند، شناسایی می‌شوند و دستگاه‌هایی که بر پایه این تکنولوژی تولید شده‌اند نیمه اتومات بوده و بیشترین استفاده را در زمینه‌های تشخیص بالینی دارند. زمان گرفتن نتیجه با این دستگاه‌ها معمولاً بین 24 تا 48 ساعت طول می‌کشد.

1. 1. • روش شناسایی اتوفلورسانس Auto fluorescence

شناسایی به روش فلورسانس در واقع شناسایی و شمارش میکروارگانیسم‌ها بر روی محیط جامد تحت نور آبی فلورسانس می‌باشد در این روش میکروارگانیسم‌ها در مراحل اولیه رشد و قبل از اینکه به صورت کلونی و با چشم غیر مسلح قابل رؤیت شوند قابل شناسایی و شمارش می‌باشند. این روش برای نمونه‌های فیلتر شونده در روش فیلتراسیون غشایی و پس از قرارگیری فیلتر روی محیط جامد و طی دوره انکوباسیون قابل استفاده می‌باشد. متعاقباً دوربین اسکنر حساس و قوی رشد میکروبی را در زمانی بسیار کوتاهتر از مشاهده مسقیم شناسایی و ثبت می‌کند. دستگاه‌های تجاری بر پایه این تکنیک معمولا مراحل آماده سازی نمونه را به صورت خودکار انجام می‌دهند.

1. 1. • فناوری‌های بر پایه حیات (Viability)

این تکنیک‌ها بر پایه لیبل دارکردن یا نشاندار کردن سلول میکروارگانیسم جهت سنجش میزان آلودگی می‌باشند. در واقع این فناوری بر اساس رشد میکروبی جهت تشخیص آلودگی نیست بلکه از تکنیک‌های لیبلینگ (نشاندار کردن) سلول برای شناسایی و اندازه‌گیری تعداد میکروارگانیسم های زنده استفاده می‌شود.
این روش پتانسیل تشخیص طیف گسترده‌ای از ارگانیسم ها، از جمله مخمر ها و قارچ‌ها را در عرض چند دقیقه دارد، اما در صورت وجود میزان بسیار کم آلودگی (کمتر از CFU/ml 10) احتمالاً یک مرحله غنی سازی مورد نیاز می‌باشد. چندین محصول تجاری بر این اساس تولید شده‌است که همه آنها از فناوری مشابه استفاده می کنند.

1. 1. • روش‌های ملکولی

در سالیان اخیر سیستم های تشخیص میکروبی که بر پایه زیست شناسی مولکولی ساخته شده‌اند پیشرفت سریعی در بخش های میکروبیولوژی بالینی و مواد غذایی داشته‌اند و در حال حاضر نیز جهت کاربردهای دارویی در دسترس هستند. از شناخته شده‌ترین این روش‌ها تکنیک واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) است که بخش های خاصی از اسیدهای نوکلئیک میکروبی را هدف قرار داده و با ازدیاد این قطعات تکنیک تشخیص بسیار خاصی را فراهم می کند. در مورد Real Time PCR که در آن ازدیاد و تشخیص به صورت همزمان انجام می‌شود،  نتایج در کمتر از سه ساعت حاصل می‌شود.
بسیاری از سیستم های تجاری PCR موجود در بازار  انواع خاص و محدودی از میکروب‌ها را هدف قرار می دهند و اکثراً کاربرد تشخیص بالینی یا غذایی دارند. مانند سالمونلا، اما محصولاتی نیز برای صنایع دارویی وجود دارد که قادر به تشخیص دامنه وسیعی از آلاینده ها هستند. امروزه روش‌های ملکولی جدیدتری مانند تکنیک‌های MALDI-TOF MASS GC MASSو NGS با دقت و صحت نتایج بسیار بالا نیز  به کمک  علم میکروبشناسی آمده‌اند.

1. 1. • آزمایش سنجش میزان اندوتوکسین

اندوتوکسین در واقع همان لیپوپلی ساکارید موجود در دیواره سلولی باکتری‌های گرم منفی می‌باشد که اندازه‌گیری میزان آن یکی از مهمترین نیازهای صنعت دارو به خصوص داروهای استریل می‌باشد. روش سنتی و معمول انجام آزمایش سنجش اندوتوکسین Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)  می‌باشد، با اینحال امروزه روش‌های نیمه خودکار سریع برای آزمایش اندوتوکسین به بازار آمده‌اند و ادعا می شود که قادر به اندازه گیری همزمان اندوتوکسین و  مطابق با برنامه های PAT هستند.

1. 1. • روش مانیتورینگ سریع هوا

پایش محیطی یکی از کلیدی‌ترین نیازهای صنعت دارویی می‌باشد، و تشخیص سریع عوامل آلودگی در فضاهای تمیز در صنعت دارویی بسیار پر اهمیت می‌باشد. روش‌های سنتی پایش میکروبی هوا و سطوح اتاق‌های تمیز بر پایه کشت میکروبی بوده که بسیار زمانبر می‌باشند. در سال‌های اخیر جهت رسیدن سریع به نتایج این آزمون‌ها از روش ATP Bioluminescence جهت پایش میکروبی سطوح و از روش‌هایی مانند SAS-PCR یا روشی به نام Mie scattering در تلفیق با لیزر جهت پایش هوای فضاهای تمیز استفاده می‌شود.

ولیدیشن روش‌های RMM

درگذشته، مشکلات اعتبار سنجی مانع جدی و اصلی برای اجرای RMM در فرآیند تولید دارو بوده است. اما اخیراً این شرایط تغییر کرده است به طوریکه انجمن داروهای تزریقی (PDA)  اولین دستوالعمل اعتبارسنجی برای RMM را به عنوان Technical Report TR-33 در سال 2013 منتشر کرد و فارماکوپه آمریکا و اروپا نیز فصل جدیدی را به ولیدیشن روش‌های میکروبیولوژی جایگزین USP 1223 & EP 5.1.6 اختصاص داده‌اند. مقامات نظارتی نیز در حال حاضر تولیدکنندگان عرصه دارو را به انجام و ولیدیشن روش‌های جدید و سریع کنترل میکروبی تشویق می‌کنند، چندین روش نیز درحال حاضر مورد تأیید FDA قرار گرفته‌است.

برآورد مالی روش‌های RMM

انتخاب یک روش سریع  پایش میکروبی مناسب، نیازمند ارزیابی دقیق فناوری‌های موجود در بازار است. در انتخاب این روش‌ها نه تنها باید به مزایا و معایب فنی ایجاد شده توجه کرد بلکه هزینه صرف شده و سود ایجاد شده نیز مسأله بسیار مهمی است. روش‌های سریع کنترل میکروبی در ابتدا نیازمند صرف هزینه بیشتری نسبت به روش‌های معمول می‌باشند ولی در دراز مدت باعث صرفه جویی قابل توجهی در هزینه‌ها می‌شوند بنابراین برای انتخاب این روش‌ها ضروری است که ROI  نیز به دقت محاسبه شود تا مبلغ سرمایه گذاری شده را توجیه کند. مواردی که در مورد ارزش‌های ایجاد شده در صورت استفاده از این روش‌های حائذ اهمیت است شامل موارد زیر می‌باشد:

1. 1. • مزایای فنی ایجاد شده
      • کاهش قابل توجه در زمان رسیدن به نتیجه در مقایسه با روش های معمول
      • مقایسه درصد بهبود حساسیت، دقت، اختصاصیت، تکرار پذیری و البته صحت نتایج نسبت به روش‌های معمول
      • درجه بالایی از اتوماسیون
      • کاهش نیاز به آموزش اپراتورها
      • مزایای تجاری ایجاد شده: تنها با ذکر این مزایا در مقابل هزینه‌های اولیه و ثانویه خرید این دستگاه‌ها، می‌توان هزینه ایجاد شده را در مورد خرید این دستگاه‌ها توجیه کرد.
      • برخی از تأمین کنندگان نیز محاسبه مزایای مالی ایجاد شده برای مشتریان این دستگا‌ه‌ها را به عهده می‌گیرند.